علوم آزمایشگاهی
زنده باد چشمان تیز بین جامعه پزشکی
درباره وبلاگ



مدیر وبلاگ : navid akbari
نویسندگان
آمار وبلاگ
  • کل بازدید :
  • بازدید امروز :
  • بازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل پست ها :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :
جمعه 15 مرداد 1395 :: نویسنده : navid akbari
رنگ آمیزی گرم (Gram Staining) :
رنگ آمیزی گرم جزء تکنیک های مهم و با کاربرد گسترده می باشد که در سال ۱۸۸۴ توسط دکتر کریستین گرم (Dr. Christian Gram) ابداع شد. این رنگ آمیزی، باکتری ها را به دو دسته ی گرم مثبت و گرم منفی طبقه بندی می کند. همچنین این رنگ آمیزی کمک به تعیین مورفولوژی سلولی، اندازه و طبقه بندی باکتری ها کرد.
اصول رنگ آمیزی :
ساختار دیواره ی سلولی ارگانیسم تعیین کننده ی گرم مثبت یا گرم منفی بودن آن ارگانیسم می باشد. زمانی که باکتری با رنگ های اولیه رنگ آمیزی و سپس فیکس شود، برخی باکتری ها توانایی حفظ رنگ اولیه را بوسیله ی مقاومت در برابر رنگ زدایی دارند در صورتی که بقیه ی باکتری ها فاقد این مقاومت بوده و رنگ زدایی می شوند. آن دسته از باکتری هایی که رنگ اولیه را نگه می دارند، گرم مثبت و آن دسته دیگر را گرم منفی می گویند.
کریستال ویوله (Crystal Violet یا CV) در محلول آبی به یون های سازنده اش (CV+ و Cl-) تقسیم می شود. این یون ها به دیواره ی سلولی و غشای سلولی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی نفوذ می کنند. یون CV+ تعامل با اجزای بخش منفی سلول های باکتریایی دارد و سلول را به رنگ بنفش در می آورد.
ید (Iodin یا I) به عنوان ماده ی تثبیت کننده با CV+ استفاده شده و کمپلکس بزرگی را از کریستال ویوله و یدین (CV-I) در طول لایه ی داخلی و خارجی سلول تشکیل می دهد.
زمانی که یک رنگزدا مانند الکل یا استون اضافه می شود، با لیپیدهای غشای سلولی واکنش می دهد.  از آنجایی که ارگانیسم های گرم منفی دارای لایه ی پپتیدوگلیکان نازکی هستند (۱ تا ۲ لایه) و نیز دارای لایه ی لیپوپلی ساکارید اضافی هستند که با اضافه کردن الکل به شکل محلول درمی آید، پس ارگانیسم های گرم منفی نمی توانند کمپلکس را نگه دارند و با شسته شدن کمپلکس، رنگ خود را نیز از دست می دهند.
در مقابل باکتری های گرم مثبت پس از اضافه کردن اتانول، دهیدراته می شوند. این کار باعث بسته شدن منافذ در دیواره ی سلولی شده و از خروج رنگ از سلول جلوگیری می کند. همچنین با توجه به ماهیت ضخیم و چند لایه ای پپتیدوگلیکان (۴۰ لایه) کمپلکس بزرگ CV-I در باکتری گرم مثبت به دام می افتد.
پس از رنگ زدایی، باکتری گرم مثبت به رنگ بنفش باقی می ماند و باکتری گرم منفی رنگ خود را از دست می دهد. سپس یک رنگ دارای بار مثبت مثل سافرانین (safranin) یا فوشین بازی (basic fuchsin) اضافه شده که باعث رنگ گرفتن باکتری های گرم منفی به رنگ صورتی یا قرمز می گردد.
آماده سازی معرف ها :
۱ : رنگ اولیه (کریستال ویوله) :
محلول A : کریستال ویوله ۲ گرم + اتیل الکل ۲۰ میلی لیتر
محلول B : آمونیوم اگزالات : ۰٫۸ گرم + آب مقطر ۸۰ میلی لیتر
محلول A و B را مخلوط کنید. به مدت ۲۴ ساعت بگذارید بماند سپس آن را از فیلتر عبور دهید و در بطری مخصوص رنگ نگهداری نمایید.
۲ : محلول تثبیت کننده (ید) :
ید : ۱ گرم
پتاسیم یدید (Potassium iodide) : 2 گرم
آب مقطر : تا ۱۰۰ میلی لیتر
همگی را با هم مخلوط کرده و در یک بطری نگهداری کنید.
۳ : رنگ زدا : ۹۵ درصد اتانول و یا نسبت ۱:۱ استون با اتانول
استون : ۵۰ میلی لیتر
اتانول (۹۵ درصد) : ۵۰ میلی لیتر
۴ : سافرانین :
سافرانین O : 0.34 گرم
الکل خالص : ۱۰ میلی لیتر
آب مقطر : ۹۰ میلی لیتر
همگی را با هم مخلوط کرده و در یک بطری نگهداری کنید.
(توجه : امروزه در اکثریت آزمایشگاه ها – تقریباً همگی – از معرف های آماده استفاده می کنند)
روش رنگ آمیزی گرم :
A : آماده سازی اسمیر (تهیه گسترش باکتریایی) :
۱ : یک اسلاید خشک بردارید (دقت کنید اسلاید چرب نباشد) و یک قطره آب مقطر روی آن بریزید
۲ : لوپ (Inoculation loop یا Smear Loop) را برداشته و روی چراغ بنزن (Bunsen burner) آن را استریل کنید.
۳ : مقداری از کشت (یا نمونه) را با لوپ استریل برداشته و در آب مقطر روی اسلاید حل کنید و سپس آن را روی سطح اسلاید گسترش دهید. (دقت کنید اسمیر نباید خیلی نازک و یا خیلی ضخیم باشد)
  • برای سوسپانسیون باکتری در آبگوشت (Broth) : با یک لوپ استریل سرد شده مقداری از آبگوشت را روی اسلاید انتقال دهید و با استفاده از حرکت دایره ای وار آن را روی اسلاید، پخش و گسترش دهید. گسترش بیش از حد می تواند باعث اختلال در آرایش سلولی گردد.
  • برای باکتری های کشت شده روی پلیت : با یک لوپ استریل سرد شده، مقداری باکتری برداشته و روی یک قطره آب استریل (نرمال سالین) روی اسلاید حل کنید و سپس گسترش دهید (لوپ را دوباره استریل کرده و در جای خود قرار دهید).
  • نمونه ی موجود در سواب (نمونه ی سواب – Swab Sample) : سواب را روی سطح اسلاید شیشه ای کشیده و گسترش دهید.
۴ : اجازه دهید اسمیر در معرض هوا خشک شود.
۵ : زمانی که اسمیر خشک شد، اسلاید را ۳ تا ۴ بار به سرعت از روی شعله عبور دهید تا فیکس شود (پشت اسلاید از روی شعله عبور داده شود).
  • فیکس کردن با حرارت باعث محکم چسبیدن باکتری ها به اسلاید شده و نیز اجازه می دهد نمونه راحت تر رنگ بگیرد.
B : رنگ آمیزی گرم :
۱ : اسلاید را در محل مخصوص رنگ آمیزی قرار دهید.
۲ : تمامی سطح اسمیر را با کریستال ویوله پوشانیده و به مدت ۱ دقیقه آن را به حال خود بگذارید
۳ : سپس اسلاید را به دقت زیر آب با فشار کم بشویید.
۴ : تمامی سطح اسمیر را با محلول ید (لوگل) پوشانیده و به مدت ۱ دقیقه آن را به حال خود بگذارید
۵ : سپس اسلاید را دوباره زیر آب با فشار کم بشویید.
۶ : اسلاید را با محلول رنگ زدا به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه می پوشانیم و یا می توان عمل رنگ زدایی را با اضافه کردن قطره قطره رنگ زدا روی اسلاید انجام داد به این صورت که اسلاید را کمی کج در دست گرفته و قطره قطره رنگ زدا را به آن اضافه می کنیم.
  • اسلاید را با شیب کمی گرفته و اتیل الکل ۹۵ درصد یا استون را قطره قطره برای ۵ تا ۱۰ ثانیه به روی اسلاید می ریزیم تا زمانی که الکل یا استون ریخته شده از اسلاید تقریباً بدون رنگ باشد.
  • مواظب باشید عمل رنگ زدایی بیش از حد انجام نشود .
  • با حرکت ملایم در استون (۳۰ میلی لیتر) و یا الکل (۷۰ میلی لیتر) برای ۱۰ تا ۳۰ ثانیه (منبع : جاوتز)
۷ : به آرامی اسلاید را زیر آب می شوییم.
۸ : تمامی سطح اسمیر را با سافرانین پوشانیده و به مدت ۳۰ ثانیه تا ۱ دقیقه آن را به حال خود بگذارید (بعضی مراجع به ۴۵ ثانیه اشاره می کنند و بعضی دیگر مثل جاوتز ۱۰ تا ۳۰ ثانیه سافرانین را پیشنهاد می کنند – سافرانین : ۲٫۵ درصد محلول در ۹۵ درصد الکل).
۹ : اسلاید را با فشار آب ملایم شسته (تا زمانی که دیگر رنگی از آن خارج نشود) سپس پشت اسلاید را با کاغذ جذب کننده یا گاز استریل خشک می کنیم
۱۰ : بررسی میکروسکوپی
تفسیر رنگ آمیزی گرم :
تفسیر نتایج حاصل از رنگ آمیزی گرم به صورت زیر است :
گرم مثبت : بنفش تیره
گرم منفی : صورتی تا قرمز تیره (در مواردی قرمز رنگ پریده)
مخمر : بنفش تیره
سلول های اپی تلیال : قرمز رنگ پریده
مثال برای باکتری های گرم مثبت :
باسیلوس، نوکاردیا، کلستریدیوم، پروپیونی باکتریوم، اکتینومایسس، انتروکوکوس، کورینه باکتریوم، لیستریا، لاکتوباسیلوس، گاردنلا، مایکوپلاسما، استافیلوکوکوس، استرپتومایسز، استرپتوکوکس و … .
مثال برای باکتری های گرم منفی :
اشرشیا، هلیکوباکتر، هموفیلوس، نایسریا، کلبسیلا، انتروباکتر، کلامیدیا، ویبریو، سودوموناس، سالمونلا، شیگلا
توجه :
  • دقت کنید اسلاید مورد استفاده چرب نباشد. چربی به جای مانده از انگشت فرد با استفاده از صابون و آب پاک می گردد. سپس باید اسلاید را با الکل نیز پاک کرد. پس از پاک و خشک شدن، اسلاید آماده ی کار می گردد.
  • این مورد بسیار اهمیت دارد که اسمیری که تهیه می کنید ضخیم نباشد، زیرا اسمیر ضخیم میزان نور عبوری از میکروسکوپ را کاهش می دهد بعلاوه تشخیص مورفولوژی سلول ها را مشکل می سازد.
  • گرمای بیش از حد برای تهیه ی اسمیر (در قسمت فیکس کردن) باعث از بین رفتن مورفولوژی طبیعی باکتری ها (تغییر حالت پروتئین های موجود در باکتری) می گردد.
  • در آماده سازی اسمیر سعی کنید اسمیر به صورت نازک باشد. در غیر این صورت جاهایی که ضخیم هست به صورت گرم مثبت ظاهر می شود.
نکات ایمنی در حین انجام آزمایش :
  • همیشه روپوش و دستکش پوشیده باشید.
  • از استفاده کردن تلفن همراه در آزمایشگاه در زمان انجام آزمایش خودداری کنید. زیرا امکان دارد آزمایش اشتباه انجام شود و  تلفن همراه نیز آلوده گردد.
  • پس وارد شدن به آزمایشگاه، مطمئن شوید میکروسکوپ به درستی کار می کند. لنزهای چشمی و شیئی باید قبل و بعد از استفاده از میکروسکوپ با دستمال تمیز شوند. لنز ۱۰۰ عدسی شیئی پس از هر بار استفاده از روغن سدر یا ایمرسیون باید تمیز گردد.
  • میزان روشنایی میکروسکوپ قبل از استفاده باید تنظیم گردد.
  • محیط کارتان را ضد عفونی کنید.
  • چراغ بنزن را تنظیم کنید. میزان مناسب آن شعله ی یک شعله ی آبی کوچک است. در صورتی که شعله زیاد باشد و یا نارنجی رنگ باشد، چراغ بنزن به حالت درست کار نمی کند.
  • اسلایدهای شیشه ای را با الکل تمیز کرده و آن را از روی شعله عبور دهید تا هرگونه ارگانیسم ناخواسته روی آن پاک شود.
  • روی یک طرف اسلاید شیشه ای حرف اول نام خود و تاریخ درست کردن اسلاید را بنویسید.
  • در زمان حرارت دادن لوپ تلقیح مطمئن شوید که تمامی قسمت های آن حرارت خورده و به رنگ نارنجی/قرمز در می آید.
  • زمانی که لوپ را حرارت دادید، آن را زمین نگذارید و یا به آن فوت نکنید و در کل کاری که باعث آلودگی آن شود انجام ندهید. در صورت آلودگی لوپ مجدداً آن را حرارت دهید تا استریل شود.
  • اجازه دهید لوپ سرد شود سپس برای برداشتن آن ارگانیسم اقدام کنید. در صورتی که با لوپ داغ شروع به برداشتن ارگانیسم ها کنید باعث می شود ارگانیسم کشته شود و در نتایج تست شما خلل ایجاد شود.
  • زمانی که درب لوله ها را برمی دارید همیشه آن ها را در دست بگیرید و هیچ گاه آن ها را روی میز و یا جایی که آن ها ممکن است آلوده شوند نگذارید.
  • همیشه لوله های آزمایش را در نزدیکی شعله چراغ بنزن گرفته و سپس اقدام به باز کردن درب آن کنید زیرا امکان آلودگی محتویات لوله توسط ذرات معلق موجود در هوا وجود دارد.
  • به محض اینکه ارگانیسم را به اسلاید انتقال دادید، لوپ خود را حرارت دهید تا استریل شود. هیچ گاه ابزار آلوده را روی میز قرار ندهید بلکه آن را ضد عفونی کرده و در جای مخصوص خود بگذارید.
  • برای انجام آزمایشات خود از کشت تازه و جوان استفاده کنید.
  • در هنگام کار با میکروسکوپ همیشه در ابتدا با عدسی شیئی ۱۰X شروع به کار کنید زیرا در این صورت منطقه ی مناسب جهت بررسی را پیدا می کنید. پس از پیدا شدن منطقه ی مناسب می توان از عدسی ۴۰X نیز استفاده کرد.
  • در هنگام کار با میکروسکوپ هیچ گاه عدسی ۱۰۰X را بدون روغن استفاده نکنید.
  • زمانی که کارتان تمام شد : عدسی های میکروسکوپ را تمیز کرده و آن را خاموش کنید. مواد آلوده را در سطل مخصوص ریخته و میز کار خود را مرتب کنید. دستانتان را شسته و ضد عفونی کنید.




نوع مطلب :
برچسب ها :
لینک های مرتبط :

یکشنبه 27 مرداد 1398 05:03 ب.ظ
Hey I know this is off topic but I was wondering if
you knew of any widgets I could add to my blog
that automatically tweet my newest twitter updates. I've been looking for a plug-in like this for quite
some time and was hoping maybe you would have some experience with something like this.
Please let me know if you run into anything. I truly
enjoy reading your blog and I look forward to your new updates.
یکشنبه 27 مرداد 1398 10:25 ق.ظ
Heya i am for the primary time here. I found this board and I to find It really
useful & it helped me out much. I am hoping to give something back and aid others
such as you helped me.
شنبه 19 مرداد 1398 05:14 ب.ظ
Thank you a lot for sharing this with all of us you really know what you are
talking about! Bookmarked. Kindly additionally consult with my web site =).
We will have a link change agreement between us
جمعه 18 مرداد 1398 02:29 ب.ظ
You need to be a part of a contest for one of the finest blogs online.
I am going to highly recommend this website!
جمعه 11 مرداد 1398 05:43 ق.ظ
I have learn some just right stuff here. Certainly price bookmarking for revisiting.
I wonder how much attempt you set to make any such
fantastic informative site.
پنجشنبه 10 مرداد 1398 09:41 ب.ظ
Good site you have here.. It's hard to find excellent writing like yours these days.
I really appreciate people like you! Take care!!
پنجشنبه 10 مرداد 1398 07:24 ب.ظ
What's up, I log on to your new stuff on a regular basis.

Your writing style is witty, keep doing what you're doing!
پنجشنبه 10 مرداد 1398 10:42 ق.ظ
I know this if off topic but I'm looking into
starting my own weblog and was wondering what all is required to get set
up? I'm assuming having a blog like yours would
cost a pretty penny? I'm not very web smart so I'm not 100% positive.
Any suggestions or advice would be greatly appreciated.
Appreciate it
دوشنبه 7 مرداد 1398 05:05 ق.ظ
Hmm is anyone else experiencing problems with the pictures on this blog loading?
I'm trying to find out if its a problem on my end or if it's
the blog. Any suggestions would be greatly appreciated.
یکشنبه 6 مرداد 1398 06:44 ب.ظ
Hi, just wanted to say, I liked this article. It was inspiring.

Keep on posting!
شنبه 28 اردیبهشت 1398 01:53 ق.ظ
Informative article, totally what I wanted to find.
سه شنبه 3 اردیبهشت 1398 08:14 ق.ظ
ルイヴィトン公式サイト同時更新17秋最新モデル-ルイ-ブランドコピー服激安通販専
چهارشنبه 28 فروردین 1398 07:01 ق.ظ
スーパーコピーブランド大人気を海外激安通販専門店!にて2010年より営業しているスーパーコピーブランド専門店です。
چهارشنبه 28 فروردین 1398 07:00 ق.ظ
スーパーコピーブランド,ブランド時計コピー日本専門店
چهارشنبه 28 فروردین 1398 07:00 ق.ظ
スーパーコピー時計N品激安通販店!スーパーコピーブランド業界の人気ブランド腕時計、バッグ、財布N品が大集合。
جمعه 17 فروردین 1397 09:08 ب.ظ

Cheers! Lots of posts!

il cialis quanto costa il cialis quanto costa buying cialis overnight cialis prices cialis soft tabs for sale buy cialis sample pack we like it cialis soft gel tadalafil 10 mg cialis without a doctor's prescription cialis canadian drugs
جمعه 3 فروردین 1397 06:02 ب.ظ

Thanks a lot! Quite a lot of knowledge!

opinioni cialis generico only now cialis 20 mg achat cialis en itali what is cialis tadalafil opinioni cialis generico tadalafil 20 mg 40 mg cialis what if i take we recommend cialis info safe dosage for cialis
دوشنبه 28 اسفند 1396 12:41 ق.ظ

With thanks. I enjoy this!
cialis canadian drugs cialis generic tadalafil buy dose size of cialis precios cialis peru cialis canadian drugs buying brand cialis online wow cialis 20 online cialis generic cialis levitra recommended site cialis kanada
شنبه 17 تیر 1396 06:23 ق.ظ
Actually no matter if someone doesn't understand then its up to other users
that they will help, so here it happens.
شنبه 17 تیر 1396 06:18 ق.ظ
Actually no matter if someone doesn't understand then its up to other users
that they will help, so here it happens.
چهارشنبه 14 تیر 1396 10:24 ق.ظ
This is very interesting, You are a very skilled blogger.
I have joined your feed and look forward to seeking more of your wonderful post.

Also, I have shared your web site in my social networks!
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر


 
   
ساخت وبلاگ در میهن بلاگ

شبکه اجتماعی فارسی کلوب | اخبار کامپیوتر، فناوری اطلاعات و سلامتی مجله علم و فن | ساخت وبلاگ صوتی صدالاگ | سوال و جواب و پاسخ | رسانه فروردین، تبلیغات اینترنتی، رپرتاژ، بنر، سئو